Регенерация и антиканцерогенез важны для борьбы со старением

Даниель Меруэло (Daniel Meruelo),
Ph.D., Professor.

Место работы: Медицинский факультет, Университет Нью-Йорка, США
(NYU School of Medicine, New York, USA).

Отрасль: генная инженерия.

Цель исследования: изучить терапевтическое значение вирусных векторов Синдбис для метастатического рака при помощи разных клинически достоверных мышиных моделей. 

Результаты: исследователи разработали метод терапии рака при помощи вирусного вектора Синдбис (Sindbis virus vector). Этот вирус относится к роду альфавирусов семейства Togaviridae. Впервые  он был выделен в августе 1952 года из комаров Culex pipiens и C. univittatus, отловленных в Египетском районе Синдбис. Вирус Синдбис широко распространен по всему миру. Его геном представлен одноцепочечной РНК (плюс цепь), репликация происходит в цитоплазме. Вирус Синдбис не интегрируется в геном хозяина. В природе передача вируса происходит от комаров к млекопитающим. Он способен преодолевать гемато-энцефалический барьер и распространяться по всему организму через кровоток. Использованные в работе вирусные векторы Синдбис не способны к репликации, поэтому не могут вызвать виремию, если не произойдет их рекомбинация. Вектор Синдбис способен вызвать апоптоз в клетках млекопитающих.

Цель первых экспериментов заключалась в определении того, может ли вектор Синдбис инфицировать клетки опухоли человека и индуцировать в них апоптоз по сравнению с клетками почки детеныша хомяка (BHK). Вектор инфицировал in vitro с высокой эффективностью культуры раковых клеток толстого кишечника (LS174T и HT29), яичника (ES-2 и SKOV-3), поджелудочной железы (CFPAC), простаты (PC-3) и печени (HuH-7), менее эффективно – раковые клеточные линии почки (A498), мочевого пузыря (HT1197) и плоскоклеточного рака вульвы (A431) [2002, Tseng JC et al., J Natl Cancer Inst.,  In vivo antitumor activity of Sindbis viral vectors]. 




Эксперименты in vivo выполняли  путем подкожного введения вышеупомянутых клеточных линий толстого кишечника и поджелудочной железы мышам линии SCID с серьезной формой
сочетанного иммунодефицита. После 4-х недель, когда опухоли достигали значительных
размеров, мышам начинали ежедневно вводить внутрибрюшинно векторы Синдбис.
Сравнение уменьшения размера опухоли проводили с мышами, не подвергавшимися
лечению. Статистически значимый результат был достигнут через 2 недели лечения
и полная  регрессия опухолей наблюдалась у некоторых мышей через 42-46 обработок [ 2002, Tseng JC et al., J Natl Cancer Inst.,  In vivo antitumor activity of Sindbis viral vectors]. 

Векторы Синдбис способны  распространяться по организму через кровоток, достигая опухолевых имплантатов в различных местах организма.   Это продемонстрировано с помощью IVIS Imaging System (Xenogen Corp., Alameda, CA)  – неинвазивного метода, который выявляет биолюминисценцию in vivo. В качестве биолюминисцентных генетических маркеров использовались гены ферментов люцифераз, которые были интегрированы в вектор и геном опухолевых клеток. Это метод позволяет следить за распространением вектора и инфицированием им опухолевых клеток у живых мышей.

Последующие эксперименты были проведены с применением модели рака яичника (карцинома). Этот вид рака имеет неблагоприятный прогноз и устойчив к некоторым хемотерапевтическим веществам, включая цисплатин. В работе были использованы клеточные линии BHK и ES-2, а также мыши с иммунодефицитом линии C.B-17-SCID.

Самкам мышей вводили внутрибрюшинно 1 млн.  ES-2 клеток. Через 5 дней в брюшной полости наблюдали несколько небольших (около 2 мм) неприкрепленных опухолевых кластеров. Гистологический анализ на данной ранней стадии заболевания выявил метастазы на сальнике, брыжейке тонкой кишке и диафрагме. В отсутствии какого-либо лечения у мышей развивался асцит и наблюдался рост опухолей сальника и брыжейки в течение 2-х недель [2004A, Tseng JC et al., Nat Biotechnol, Systemic tumor targeting and killing by Sindbis viral vectors].

Колокализацию векторов и опухолей исследовали при помощи люцифераз кораллов и жуков-светляков. ES-2/Fluc клетки экспрессировали ген люциферазы светляка, а векторы Синдбис (Sindbis/Rluc) – ген люциферазы коралла Renilla renifomis (Rluc). Выявляли биолюминисцентную активность этих двух ферментов in vivo. Однократное внутрибрюшинное введение вектора приводило к эффективному инфицированию клеток метастазирующей опухоли.


С целью исследования воздействия вектора Синдбис на нормальные клетки организма его вводили мышам с 5-дневными опухолевыми имплантатами (ES-2 клетки) и контрольным особям, которым ES-2 клетки не вводились. У контрольных мышей без опухолей в брюшной полости биолюминисцентный сигнал выявлен не был. Тогда как у мышей с опухолями  биолюминисценцию наблюдали, причем исключительно в опухолях, а не в нормальных органах (печень, мозг, почки).  Это говорит в пользу специфичности вектора Синдбис в отношении клеток опухолей.

Кроме этого, исследователи проводили эксперимент по введению векторов Синдбис, несущих гены бактериальной бета-галактозидазы, интерлейкина-12 и интерлейкина-15 мыши (Sindbis/LacZ, Sindbis/IL-12, Sindbis/IL-15 соответственно). Известно, что интерлейкины активируют собственные клетки-киллеры, которые обладают антиопухолевым действием. Однако в данных экспериментах одни цитокины не были эффективными. Вектор Sindbis/LacZ значительно подавлял  развитие заболевания по сравнению с контролем (мыши с опухолями, не подвергавшиеся лечению), а гены цитокинов еще более повышали антиопухолевое действие векторов Синдбис [2004, Tseng JC et al., Cancer Res, Using Sindbis viral vectors for specific detection and suppression of advanced ovarian cancer in animal models]. 



Для того чтобы исключить возможность избирательного тропизма вектора в отношении клеток человека, был проделан еще один подобный эксперимент, в котором использовали клетки опухоли яичника мыши. Результат был аналогичным: Синдбис вектор инфицировал исключительно клетки опухоли.

Вирус Синдбис, как известно, инфицирует клетки млекопитающих, используя  67 кДа рецептор
ламинина (LAMR), количество которого повышается в опухолях по сравнению с нормальными клетками. В отличие от нормальных клеток, в раковых большая часть рецепторов ламинина не связано с ламинином. Снижение уровня экспрессии рецептора ламинина малыми интерферирующими РНК значительно уменьшает инфекционную способность векторов Синдбис. Сверхэкспрессия ламининового рецептора может объяснить специфичность и эффективность, которую вирус Синдбис демонстрирует в отношении клеток опухоли in vivo. Лазерная микродиссекция имплантатов опухоли мыши показала равные уровни экспрессии рецептора ламинина в метастазах различных опухолей в брюшной полости [2006, Hurtado et al., Rejuvenation Res., Gene therapy that safely targets and kills tumor cells throughout the body]
 

Таким образом, при помощи диагностической визуализации, гистологических и молекулярных данных, исследователи установили, что Синдбис векторы   системно и специфически распознают,  поражают и разрушают метастазирующие опухоли in vivo. Это приводит к значительному подавлению роста опухоли и повышению выживаемости экспериментальных животных. Хотя в экспериментах, выполненных на модели рака яичника, полная ремиссия не была достигнута.


Публикации по теме:

Многофункциональность 37/67 кДа рецептора ламинина - подходящая мишень для новой генетической терапии рака.
Multiple functions of the 37/67-kd laminin receptor make it a suitable target for novel cancer gene therapy
Tseng J.C., Granot T., Digiacomo V., Levin B., Meruelo D.
Mol Ther 2010 Jan;18(1):63-74. .
Вирус, вектор, раковые клетки, генная терапия, рецептор ламинина.

Кристаллическая структура предшественника рецептора ламинина человека.
Crystal structure of the human laminin receptor precursor.
Jamieson K.V., Wu J., Hubbard S.R., Meruelo D.
J Biol Chem. 2008 Feb 8; 283(6):3002-5.
Вирус, рецептор ламинина.

Генная терапия для безопасного поиска и уничтожения раковых клеток по всему организму.
Gene therapy that safely targets and kills tumor cells throughout the body.
Hurtado A., Tseng J.C., Meruelo D.
Rejuvenation Res. 2006 Spring; 9(1):36-44.
Вирус, вектор, раковые клетки, генная терапия.

Использование вирусного вектора Синдбис для специфического выявления и подавления рака яичников последней стадии на животных моделях.
Using sindbis viral vectors for specific detection and suppression of advanced ovarian cancer in animal models.
Tseng J.C., Hurtado A., Yee H., Levin B., Boivin C., Benet M., Blank S.V., Pellicer A., Meruelo D.
Cancer Res. 2004 Sep 15; 64(18): 6684-92.
Вирус, вектор, раковые клетки, генная терапия.

Противоопухолевая активность вирусного вектора Синдбис в экспериментах in vivo.
In vivo antitumor activity of Sindbis viral vectors.
Tseng J.C., Levin B., Hirano T., Yee H., Pampeno C., Meruelo D.
J Natl Cancer Inst. 2002 Dec 4;94(23):1790-802.
Вирус, вектор, раковые клетки, генная терапия.

Контакты:

New York University School of Medicine, USA.
Address: MSB 5 598/597
Street: 550 First Avenue
City/state/zip: New York NY 10016
Email:Daniel.Meruelo@nyumc.org
Phone: +1 212 263 5599
Fax: +1 212 263 8211
Web-site: http://pathology.med.nyu.edu/people/faculty/meruelo-daniel
http://www.med.nyu.edu/people/merued01.html

Джеймс Моррэ (D. James Morré),
Ph.D., Professor

Место работы: Кафедра по пищевым продуктам и питанию, Университет Пурдю, США
(Department of Foods and Nutrition, Purdue University, West Lafayette, USA).

Отрасль: фармакология.

Ботанический Научно-исследовательский центр возрастных заболеваний, организованный совместно  университетами  Пурдю и Алабамы-Бирмингема, использует междисциплинарные и инновационные технологии для исследования  биодоступности биоактивных растительных полифенолов и их влияние на состояние здоровья человека. Значительное количество возрастных заболеваний связано с окислительным стрессом и повреждением тканей. Одно из направлений исследований Центра – изучение биодоступности биоактивных природных соединений из сложных растительных смесей больными органами, определение их усвояемости и метаболизма, а также соотнесение этих данных с их защитными свойствами. Главная цель Центра: исследование действия растительных компонентов против резорбции костей, влияния на когнитивные  функции мозга, сосудистую систему и предотвращение рака.

Цель исследования: изучить воздействие растительных полифенолов (катехинов и ваниллоидов) на раковые клетки.

Результаты исследования: На основании эпидемиологических данных и данных, полученных в экспериментах на животных выявлена возможная роль полифенолов чая (катехинов) в профилактике некоторых хронических заболеваний, таких как рак, сердечно-сосудистые нарушения и ожирение.  Однако  предполагается, что низкая биодоступность катехинов при пероральном применении снижает их потенциальный эффект в связи с ограниченными концентрациями в определенных тканях-мишенях. Считается, что это связано с их нестабильностью при переваривании, плохим трансцеллюлярным оттоком в клетках кишечника, быстрым метаболизмом и выведением (2006, Feng, Curr Drug Metab.,Metabolism of green tea catechins: an overview). При помощи модельной культуры клеток кишечника Caco-2  in vitro  была  оценена стабильность катехинов зеленого чая в пищеварительной системе, а также их усвояемость в кишечнике из различных смесовых напитков (2006, Ferruzzi et al., J Agric Food Chem.,Digestive Stability, micellarization, and uptake of beta-carotene isomers by Caco-2 human intestinal cells).



В Центре под руководством Дж. Моррэ исследуется взаимодействие между катехинами и поверхностным белком раковых клеток ECTO-NOX, обозначаемым как ENOX2 или tNOX (Genbank Accession No. AF207881) (2002, Chueh et al., Biochemistry,Molecular cloning and characterization of a tumor-associated, growth-related, and time-keeping hydroquinone (NADH)
oxidase (tNOX) of the HeLa cell surface). Этот белок уникальным образом связан со всеми формами рака человека и отсутствует у нормальных клеток и тканей. Его активность коррелирует с ростом раковой опухоли. tNOX является специфической мишенью для низких доз катехинов зеленого чая (2000, Morré et al., Biochem Pharmacol., Preferential inhibition by
(-)-epigallocatechin-3-gallate of the cell surface NADH oxidase and growth of transformed cells in culture). Специфичность раковых клеток связана с экспрессией сплайс-варианта белка (Tang et al., 2007), который избирательно подавляется лекарством (2002, Chueh et al., biochemistry,Molecular cloning and characterization of a tumor-associated, growth-related, and time-keeping hydroquinone (NADH) oxidase (tNOX) of the HeLa cell surface). При ингибировании белка tNOX раковых клеток, они прекращаю рост, перестают делиться и через несколько дней подвергаются апоптозу (2006, Morré & Morré, Rejuvenation Res.,Catechin-vanilloid synergies with potential clinical applications in cancer).

Наиболее эффективно рост раковых
клеток подавляется препаратом, в котором наряду с катехинами присутствует ваниллоид
 жгучего перца – капсаицин. Это соединение относится к алкалоидам – ваниламидам карбоновых кислот Capsicum L. (сем. Solanaceae). Концентрат зеленого чая и жгучего перца в соотношении 25:1 убивает раковые клетки в культуре в 100 раз лучше, чем один чай. Подсчитано, что 350 мг капсула имеющегося в продаже катехино-ваниллоидного препарата (Capsibiol-T® или Capsol-T®) приблизительно равнозначна 16 выпитым  чашкам зеленого чая (из расчета 2 г чая на чашку). Эти данные основаны на сравнении роста клеточных культур 4T1 и HeLa (2003, Morré & Morré, J Pharm Pharmacol.,Synergistic Capsicum-tea mixtures with anticancer activity).




Катехины, ваниллоиды и зеленый чай не подавляют рост нераковых клеточных линий в культуре, не ингибируют активность соответствующих белков NOX в нормальных клетках как по отдельности, так и в комбинации друг с другом.

Дальнейшие исследования in vitro показали, что экспрессия tNOX необходима и достаточна для специфического подавления роста раковых клеток, вызванного (−)-эпигаллокатехин-3-галлатом
(EGCg) (2004, Chueh et al., Biofactors., tNOX is both necessary and sufficient as a cellular
target for the anticancer actions of capsaicin and the green tea catechin (-)-epigallocatechin-3-gallate). Были созданы трансгенные мыши со сверхкспрессией гена tNOX. В экспериментах in vivo у них были продемонстрированы высокий уровень неконтролируемого роста клеток и их чувствительность к EGCg, подобная выявленной в экспериментах с  раковыми клетками (2006, Yagiz et al., J Nutr Biochem.,Transgenic mouse line overexpressing the cancer-specific tNOX protein has an enhanced growth and acquired drug-response phenotype).

По некоторым предварительным исследованиям, проведенным в Центре с участием 50 больных раком, у 36% пациентов, принимавших Capsol-T®,  жизнь была более продолжительной, либо они остались в живых, 32% пациентов – выздоровели и 32% имели нормальную динамику болезни (2006, Morré & Morré, Rejuvenation Res.,Catechin-vanilloid synergies with potential clinical applications in cancer). В настоящее время, проходит Фаза II/III клинических испытаний препарата Capsol-T® (токсикология и фармакокинетика) в отношении рака почки и меланомы под руководством Д-ра Теодора Логана (Медицинский факультет Университета Индианы), а также более обширное клиническое исследование по оценке эффективности в Онкологическом центре Гошена (Индиана). Исследование, проведенное с участием пяти пациетов, больных раком, выявлено положительное взаимодействие между катехино-ваниллоидным препаратом и лучевой терапией (Fernandez & Ganzon, 2003).

Публикации по теме:

Ключевые научные исследования Ботанического научно-исследовательского центра университетов Пурдю-УАБ по возрастным заболеваниям.
Research Highlights from the Purdue-UAB Botanicals Research Center for Age Related Diseases.
Weaver CM, Barnes S, Wyss JM, Kim H, Morré DM, Morré DJ, Simon JE, Lila MA, Janle EM, Ferruzzi MG.
Pharm Biol. 2009 Aug 1;47(8):768-773.

Фармакокинетика катехинов зеленого чая в виде экстракта и препаратов пролонгированного действия.
Pharmacokinetics of Green Tea Catechins in Extract and Sustained-Release Preparations.
Janle EM, Morré DM, Morré DJ, Zhou Q, Zhu Y.
J Diet Suppl. 2008 Nov 1;5(3):248-263.

Потенциальное клиническое применение синергических смесей катехин-ваниллоидов при раковых заболеваниях.
Catechin-vanilloid synergies with potential clinical applications in cancer.
Morré DM, Morré DJ.
Rejuvenation Res. 2006 Spring;9(1):45-55.

Контакты:

Foods and Nutrition
Purdue University
700 W. State Street
West Lafayette, IN
47907-2059
Phone: (765) 494-8228
Fax: (765) 494-0674
E-mail: morre@pharmacy.purdue.edu
Web-site: http://www.cfs.purdue.edu/fn/bot/Research/Project/project3.htm

Чжэн Цуй (Zheng Cui),
Ph.D., Associate Professor.

Место работы: Кафедра патологии, Медицинский факультет, Университет Уэйк Фореста, Уинстон-Сейлем, Северная Каролина, США
(Department of Pathology, Wake Forest University School of Medicine Winston-Salem, North Carolina, USA).

Отрасль: иммунология.

Цель исследования: изучить врожденный иммунный противораковый ответ у мышей.


Результаты исследования: В лаборатории Чжэна Цуя в линии мышей BALB/c были обнаружены особи, устойчивые к введению в организм больших летальных доз раковых клеток. Из этих особей была основана линия SR/CR (Spontaneous regression/complete resistant=спонтанная ремиссия/полностью невосприимчивые). Установлено, что эта устойчивость связана с наличием у них лейкоцитов, способных к выявлению и уничтожению раковых клеток в течение нескольких часов после заражения [2003, Cui Z, Proc Natl Acad Sci U S A,Spontaneous regression of advanced cancer: identification of a unique genetically determined, age-dependent trait in mice]. Ключевыми компонентами этого ответа являются гранулоциты, моноциты и естественные клетки-киллеры, которые обуславливают врожденный клеточный иммунитет. Было выявлено, что адоптивный перенос донорных лейкоцитов из линии мышей SR/CR может обеспечивать защиту чувствительных к раку мышей дикого типа от последующего введения им раковых клеток, а также уничтожение уже имеющихся злокачественных опухолей без дополнительных процедур [2006, Hicks AM et al., Proc Natl Acad Sci USA, Transferable anticancer innate immunity in spontaneous regression/complete resistance mice].

Это исследование предполагает возможность разработки аналогичного метода переноса лейкоцитов для человека, если получится выявить людей с подобной анти-раковой активностью лейкоцитов и использовать их в качестве доноров. Однако существуют некоторые сложности. Перенос лейкоцитов у мышей был осуществлен с учетом главного комплекса тканевой совместимости (ГКТС), кроме мыши-реципиенты были относительно молодыми [2006, Hicks AM et al., Proc Natl Acad Sci USA, Transferable anticancer innate immunity in spontaneous regression/complete resistance mice].

В случае человека обстоятельства могут быть крайне разными. Во-первых, неизвестно, насколько может влиять пол донора лейкоцитов. Предполагается, что при переносе женских лейкоцитов мужчинам не должно возникать серьезных проблем. Тогда как в обратном случае они могут иметь место, т.к. существуют уникальные белки, связанные с экспрессией генов Y-хромосомы [2005, Miklos DB et al., Blood, Antibody responses to H-Y minor histocompatibility antigens correlate with chronic graft-versus-host disease and disease remission].  Однако не ясно, до какой степени этот тип несовместимости будет влиять на функционирование мужских донорных лейкоцитов, и является ли это несоответствие достаточным, чтобы сделать их непригодными для использования у реципиентов женского пола.

Во-вторых, в случае человека, следует избегать долгосрочного приживления трансплантата, особенно это касается Т-лимфоцитов. Такая необходимость связана со снижением вероятности возникновения реакции трансплантата против хозяина (РТПХ) [2008, Dwyre DM,  Vox Sang., Transfusion-associated graft-versus-host disease].

Долговременное приживание донорских лейкоцитов иммунокомпетентным людям обычно связано с частичным или почти полным соответствием антигенов лейкоцитов (АЛЧ) донора и реципиента, как наблюдается у родственников. Одним из способов избегания таких последствий может являться перенос донорских лейкоцитов иммунокомпетентному пациенту, выбранных по принципу полного несоответствия по АЛЧ. Оно приводит к тому, что в течение нескольких недель или месяцев лейкоциты донора будут отторгнуты.

Первые эксперименты, проведенные на мышах, показали, что донорские лейкоциты могут работать быстро, в течение нескольких дней или 2-3 недель у особей со схожим ГКТС. В случае человека полное несоответствие по АЛЧ должно минимизировать риск развития реакции трансплантата против хозяина из-за своевременного отторжения клеток донора. Пока неизвестно, будут ли способны лейкоциты функционировать до момента отторжения организмом реципиента или нет.  

В-третьих, предварительное исследование выполнено на молодых мышах, как донорах, так и реципиентах [2006, Hicks AM et al., Proc Natl Acad Sci USA, Transferable anticancer innate
immunity in spontaneous regression/complete resistance mice]. Известно, что у человека в пожилом возрасте могут наблюдаться значительные нарушения функций иммунной системы, поэтому предположено, что молодые люди могут являться лучшими донорами. Даже если в качестве доноров использовать более молодых людей, лейкоциты будут переноситься онкологическим больным, которые, как правило,  пожилые [2008, Jemal A, CA: a cancer journal for clinicians, Cancer statistics]. На основании результатов ранее проведенных исследований было предположено, что более зрелое клеточное окружение может содержать циркулирующие факторы, которые будут подавлять функционирование лейкоцитов молодого донора [2005, Conboy IM,  Nature, Rejuvenation of aged progenitor cells by exposure to a young systemic environment].

Дальнейшая работа Чжэна Цуя [2009, Stehle JR et al., BMC Cancer, Impact of sex, MHC, and age of recipients on the therapeutic effect of transferred leukocytes from cancer-resistant SR/CR mice]
и его коллег была посвящена исследованию влияния пола, ГКТС и возраста на терапевтический эффект донорских лейкоцитов мышей линии SR/CR у мышей дикого типа.

При переносе лейкоцитов от самок-доноров к самцам-реципиентам влияния несоответствия по полу на функциональность лейкоцитов не выявлено. Наоборот, лейкоциты самца-донора в значительной степени подвергались воздействию у самок-реципиентов. Таким образом, выживаемость у самок-реципиентов была ниже, чем у самцов. При несоответствии по ГКТС выявлен более значительное отрицательное воздействие на лейкоциты донора, чем при несоответствии по полу. Т.е. выживаемость реципиентов была ниже. Негативные эффекты
несоответствия доноров и реципиентов по полу и ГКТС суммировались.





Лейкоциты старых доноров функционировали хуже, чем лейкоциты молодых доноров во всех случаях, включая молодых реципиентов. Молодые реципиенты не могли восстановить снижение функционирования лейкоцитов старого донора. Функционирование клеток молодых доноров у старых реципиентов постепенно снижалось, предполагая то, что клеточное окружение у старой особи может содержать факторы, которые оказывают неблагоприятное действие на работу перенесенных клеток.

Облучение донорских лейкоцитов перед переносом оказывало сильное подавляющее действие на их функционирование, возможно, из-за нарушения процесса транскрипции. Криоконсервация лейкоцитов донора в жидком азоте не оказывала явного влияния на их функции, за исключением утраты некоторого количества клеток после размораживания.

Несмотря на подавление функционирования донорских лейкоцитов в случае несовместимости по полу и ГКТС, а также у пожилых реципиентов, имеется терапевтический интервал времени (нескольких недель), во время  которого донорские лейкоциты функционируют перед своим отторжением или снижением функционирования. В связи с этим, использование лейкоцитов от здоровых доноров с противораковой активностью может являться возможным терапевтическим методом для лечения злокачественных новообразований.




Публикации по теме:

Влияние пола, ГКТС и возраста реципиентов на терапевтический эффект лейкоцитов, перенесенных от устойчивых к раку мышей линии SR/CR.
Impact of sex, MHC, and age of recipients on the therapeutic effect of transferred leukocytes from cancer-resistant SR/CR mice.
Stehle JR et al. BMC Cancer. 2009.

Эффекторные механизмы противоракового иммунного ответа макрофагов у мышей линии SR/CR.
Effector mechanisms of the anti-cancer immune responses of macrophages in SR/CR mice.
Hicks AM, Willingham MC, Du W, Pang CS, Old LJ, Cui Z.
Cancer Immun. 2006 Oct 31;6:11.

Влияние старения на противораковый клеточный иммунитет у мышей SR/CR.
The effect of aging on cellular immunity against cancer in SR/CR mice.
Cui Z, Willingham MC.
Cancer Immunol Immunother. 2004 Jun;53(6):473-8.

Спонтанная регрессия рака на поздних стадиях: выявление уникального, генетически детерминированного, зависимого от возраста свойства у мыши.  
Spontaneous regression of advanced cancer: identification of a unique genetically determined, age-dependent trait in mice.
Cui Z.  et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100:6682–6687.

Извилистый путь открытия SR/CR мышей.
The winding road to the discovery of the SR/CR mice.
Cui Z.Cancer Immun. 2003 Oct 16;3:14.


Контактная информация:

Department of Pathology,
Wake Forest University School of Medicine Winston-Salem, North Carolina 27157, USA.
Phone: 336-716-2650Fax: 336-716-7595
E-mail: zhengcui@wfubmc.edu
Web-site: http://www2.wfubmc.edu/molecular_genetics/Faculty+Members/Cancer/Cui/

Эллен Хебер-Кац (Ellen Heber-Katz),
Professor

Место работы: Институт Вистара, Филадельфия, Пенсильвания, США
(The Wistar Institute, Philadelphia, Pennsylvania, USA).

Отрасль: клеточная биология.

Цель исследования: изучить процесс регенерации при повреждении тканей у мышей линии MRL.

Результаты исследования: Эллен Хебер-Кац  и ее коллеги обнаружили, что мыши линии MRL имеют уникальную способность к самоисцелению: у них наблюдается замещение поврежденной ткани без образования рубца. Способность к восстановлению тканей и конечностей известна для многих животных, не относящихся к млекопитающим. Однако взрослые MRL мыши способны к регенерации хрящей, кожи, волосяных фолликулов, миокарда. Исследователи предположили, что мыши данной линии могут служить моделью непрерывной регенерации и, возможно,  обладают более продолжительной жизни. В своих экспериментах, учёные использовали классический «бессмертный» организм – гидру – для сравнения и оценки  основных характеристик «бессмертия». Оценивали скорость пролиферации и скорость гибели клеток, которая приводит к  непрерывной замене клеток без изменения массы [2006, Heber-Katz E. et al.,Rejuvenation Research, Conjecture:Can Continuous Regeneration Lead to Immortality? Studies in the MRL Mouse].

Впервые высокий уровень регенерации у мышей линии MRL был выявлен благодаря их необычной способности к восстановлению сквозных отверстий в ушах [1999, Heber-Katz E., Semin Cell Dev Biol., The regenerating mouse ear.,1999], а затем в экспериментах по структурному и функциональному восстановлении миокарда после серьезного криоповреждения [2002, Leferovich, J. M. & Heber-Katz E.,  Semin. Cell Dev., The scarless heart]. Авторы предоставили гистологические, биохимические и генетические данные, указывающие на то, что высокий уровень рассасывания рубцовой ткани может являться основополагающим фактором в процессе регенерации у данных мышей.

MRL мыши были получены при скрещивании мышей линий LG (75%; H-2d/f), AKR (12.6%; H-2k), C3H (12.1%; h-2k) и C57B1/6  (0.3%; H-2b) [Murphy & Roths 1979]. Они отбирались по признаку большого размера. Было выявлено, что они имеют значительные  нарушение в иммунной регуляции. С возрастом лимфоциты в лимфатических узлах и селезёнка проявляют неконтролируемую пролиферацию (lpr), которая легко выявляется при визуальном осмотре мышей в виде выступа под кожей. Этот фенотип определялся одним геном fas, который вовлечен в процесс некроза клеток. Было показано, что мутация lpr связана с инсерцией ретротранспозона в ген fas [1992, Watanabe-Fukumaga et al., Nature, Lymphoproliferation disorder in mice explained by defects in Fas antigen that mediates apoptosis], приводит к отсутствию клеточной гибели и проявляется во множественных аутоиммунных эффектах.  

Молодые мыши MRL способны восстанавливать сквозное отверстие в ухе 2 мм диаметром за 30 дней, тогда как у обычных мышей такого не происходит и отверстие сохраняется в течение
всей жизни [1999, Heber-Katz E., Semin Cell Dev Biol., The regenerating mouse ear.,1999]. Наблюдается нормальный рост и нормальная гистологическая структура, как при регенерации у амфибий, тогда как обычно у млекопитающих происходит образование рубца.  У гибридов MRL мышей с мышами других линий наблюдается промежуточный тип зарастания поврежденного хряща. Проведенный генетический анализ позволил сделать вывод о том, что, по крайней мере, 20 разных локусов ответственны за эту способность  [ 2004, Heber-Katz et al., Wound Repair Regen, Novel genetic loci associated with wound healing and regeneration that distinguish MRL and M. m. castaneus mice]. Процесс регенерации уха происходит у самцов и самок по-разному [2003, Blankenhorn et al., Mamm Genome, Sexually dimorphic genes regulate healing and regeneration in MRL mice].

Считается, что у млекопитающих сердце не способно к регенерации, хотя у других позвоночных животных она может иметь место. Исследователи производили криоповреждение сердца мышей линий MRL and B6 через диафрагму. Через 60 дней у мышей MRL наблюдали восстановление миокарда, в некоторых случаях выявлен небольшой рубец. Тогда как у контрольных особей B6 выявлялся неклеточный рубец [2001, Leferovich et al., Proc Natl Acad Sci U S A, Heart regeneration in adult MRL mice]. Проведенные позже эхокардиография и гистологический анализ миокарда мышей выявили полное восстановление сердца у особей линии MRL [2001, Leferovich et al., Proc Natl Acad Sci U S A, Heart regeneration in adult MRL mice; 2002, Leferovich, J. M. & Heber-Katz E.,  Semin. Cell Dev., The scarless heart ].  Исследователи предположили, что восстановление миокарда может быть связано либо с миграцией кардиомиоцитов в поврежденную зону, либо с  активностью стволовых клеток. Было обнаружено, что на 7-15 день после повреждения кардиомиоциты экспрессируют Ki-67, являющийся маркером пролиферации.
Исследование по восстановлению поврежденного спинного мозга позволили выявить соединение, которое участвует в процессе регенерации, - аполипопротеин Е [2003, Seitz A, J.

Neuroscience Research, Apo-E expression after spinal cord injury in the mouse].

В целом, эксперименты, проведенные Эллен Хебер-Кац  ее коллегами на мышах линии MRL по восстановлению хрящевой ткани уха, повреждений сердечной мышцы и спинного мозга предполагают то, что  регенерация ткани подавляется процессом формирования рубца. Это открытие открывают перспективу исследования регенеративных возможностей и у человека.


Публикации по теме:

Генетические локусы, регулирующие процессы заживления и регенерации у мышей линий LG/J и SM/J
Genetic loci that regulate healing and regeneration in LG/J and SM/J mice.
Blankenhorn EP et al.
Mamm Genome. 2009 Nov-Dec;20(11-12):720-33.

Гипотеза: Может ли последовательная регенерация привести к бессмертию? Исследования мышей линии MRL.
Conjecture: Can continuous regeneration lead to immortality? Studies in the MRL mouse.
Heber-Katz E. et al. 
Rejuvenation Res. 2006 Spring;9(1):3-9.

Ответная реакция видоизмененной ЦНС на повреждение у мышей MRL/MpJ.
Altered CNS response to injury in the MRL/MpJ mouse.
Hampton DW et al. 
Neuroscience. 2004;127(4):821-32.

Восстановление сердечной мышцы без образования рубца.
The scarless heart and the MRL mouse.
Heber-Katz E et al.
Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2004 May 29;359(1445):785-93.

Регенерация уха у мыши.
The regenerating mouse ear.
Heber-Katz E.
Semin Cell Dev Biol. 1999 Aug;10(4):415-9.


Контактная информация:

Wistar Institute
3601 Spruce St.
Philadelphia, PA 19147
Phone: (215) 898-3710
E-mail: heberkatz@wistar.org
Web-site: http://www.wistar.org/research_facilities/heberkatz/research.htm

Кельвин Харли (Calvin Harley)

Место работы: Корпорация "Герон", Калифорния, США
(Geron Corporation, California, USA).

Отрасль: молекулярная биология.

Цель исследования: поиск возможностей управления процессами регенерации, канцерогенеза через воздействие на активность теломеразы.

Результаты исследования: Кельвин Харли известен своей новаторской работой по
клеточным основам старения, роли теломер и теломеразы в смерти и бессмертии клеток,
а также в развитии возрастных заболеваниях, включая рак. Он и его коллеги впервые продемонстрировали, что теломеры укорачиваются с возрастом в нормальных делящихся клетках, и этот процесс связан с клеточным старением. Было выявлено, что раковые клетки избегают гибели благодаря ферменту теломеразе. Д-р Харли с коллегами разработали широко используемый способ оценки активности теломеразы. И были первыми исследователями, клонировавшими гены РНК-  и белкового компонентов данного рибонуклеопротеинового комплекса. 

Укорочение теломер ограничивает продолжительность жизни соматических клеток человека  в культуре. Это имеет место во время репликативного старения  in vivo у человека и мыши в кроветворных клетках, включая их ранних предшественников и стволовые клетки крови (hematopoietic stem cells, HSCs), не смотря на выявляемую в них активность теломеразы. С целью оценки важности теломеразы для долговременных репликативных возможностей  исследователи последовательно трансплантировали in vivo HSCs от мышей дикого типа и мышей с недостаточной теломеразной активностью и регистрировали длину теломер в течение этого процесса. HSCs с недостаточной теломеразной активностью могли быть трансплантированными только два раза, а клетки от мышей дикого типа – четыре. Причем в первом случае скорость укорочения теломер была выше приблизительно в два раза, чем во втором. Это позволило предположить, что одной из возможных функций  теломеразы в стволовых клетках крови является контролирование скорости укорочения теломер во время деления. Она предотвращает преждевременную утрату функций теломер и обеспечивают дополнительные репликативные возможности [2003, Allsopp RC et al., Blood, Telomerase is required to slow telomere shortening and extend replicative lifespan of HSCs during serial transplantation].

Ряд исследований выявил роль пониженной активности теломеразы и коротких теломер в развитии целого спектра заболеваний: (a) Люди с укороченными по сравнению со средними значениями длинами теломер имеют более высокую вероятность гибели от сердечных
заболеваний, инсульта или инфекций; (b) Пациенты с наследственным дискератозом рождаются с укороченными теломерами из-за мутаций в генах субъединиц теломеразы. Они страдают от нарушения пролиферации  и обычно рано умирают от недостаточности костного мозга; (c) Люди, страдающие хроническим стрессом или инфекциями имеют более высокую скорость укорочения теломер по сравнению с ровесниками. В связи с этим, активация теломеразы может способствовать терапии данных заболеваний. 

Деление клеток человека в культуре связано с утратой теломерной ДНК. Такие клетки подвержены изменениям, аналогичным происходящим с возрастом и при некоторых заболеваниях  in vivo. Трансдукция теломеразы в клетки увеличивает их репликативные возможности, устойчивость к стрессу, повышает функциональную активность in vitro и in vivo без потери способности к дифференцировке и контроля роста.  Кроме того, трансдукция теломеразы  in vivo может предотвратить дисфункцию теломер и циррозные изменения в печени у мышей, нокаутированных по гену теломеразы.  Таким образом, активация теломеразы при помощи фармакологических средств имеет огромное значение для лечения широкого спектра как хронических, так и дегенеративных заболеваний [2005, Harley CB., Curr Mol Med., Telomerase therapeutics for degenerative diseases].

Кельвин Харли также занимается поиском способов воздействия на теломеразу для подавления активности раковых клеток [2008, Harley CB., Nat Rev Cancer, Telomerase and cancer therapeutics].


Публикации по теме:

Иметелстат (GRN163L) - терапия рака при помощи теломеразы.
Imetelstat (GRN163L) - Telomerase-Based Cancer Therapy.
Röth A, Harley CB, Baerlocher GM.
Recent Results Cancer Res. 2010;184:221-34.

Теломераза и терапия рака.
Telomerase and cancer therapeutics.
Harley CB.
Nat Rev Cancer. 2008 Mar;8(3):167-79.

Лечение дегенеративных заболеваний при помощи теломеразы.
Telomerase therapeutics for degenerative diseases.
Harley CB.
Curr Mol Med. 2005 Mar;5(2):205-11.

Насколько долго могут существовать теломеры?
How long should telomeres be?
Aviv A, Harley CB.
Curr Hypertens Rep. 2001 Apr;3(2):145-51.

Экспрессия теломеразы восстанавливает целостность кожи в экспериментах in vitro с искусственно состаренными фибробластами.
Telomerase expression restores dermal integrity to in vitro-aged fibroblasts in a reconstituted skin model.
Funk WD et al.
Exp Cell Res. 2000 Aug 1;258(2):270-8.

Старение, связанное с теломерами.
Telomere-dependent senescence.
Kipling D. et al.
Nat Biotechnol. 1999 Apr;17(4):313-4.


Контактная информация:

Geron Corporation
230 Constitution Drive
Menlo Park, CA 94025 USA
Phone: 650-473-7700
Fax: 650-473-7750
E-mail: CHarley@Geron.com
Web-site: http://www.geron.com/

Эдвин Гудвин (Edwin Goodwin)

Место работы: Отдел биологических наук, Национальная лаборатория Лос-Аламоса, Нью-Мехико, США (Bioscience Division, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM, USA).

Отрасль: клеточная биология, онкология.

Цель исследования: изучение альтернативного способа удлинения теломер в раковых клетках.

Старение нормальных соматических клеток человека наступает после прохождения ими ограниченного числа делений – достижения лимита Хейфлика [1965, Hayflick L., Exp Cell Res., The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains]. При каждом делении они теряют около 100-400 п.о. теломерной ДНК, состоящей из повторов TTAGGG. Эти клетки остаются живыми, но перестают делиться [2000,  Martens U.M. et al., Exp. Cell Res, Accumulation of short telomeres in human fibroblasts prior to replicative senescence].  Укорочение связано с  неспособностью ДНК-полимеразы реплицировать самый конец матрицы во время синтеза отстающей цепи ДНК. Модель старения клеток предполагает, что одна или несколько теломер укорачиваются более некого критического предела, вследствие чего хромосомы не могут формировать защитные концевые структуры. Неспособность клеток  восстанавливать это «повреждение» приводит к нестабильности их дальнейших делений и впоследствии клетка гибнет.

В отличие от нормальных клеток, раковые пролиферируют неограниченно, что приводит к образованию опухоли [2001, Campisi J., Trends Cell Biol., Cellular senescence as a tumor-suppressor mechanism]. Инактивация генов p53 и Rb приводит к пролиферации таких клеток с критически  короткими теломерами вопреки лимиту Хейфлика. При этом хромосомная нестабильность растет. Критический момент наступает, когда значительная нестабильность препятствует размножению необходимого  для поддержания пролиферации количества жизнеспособных клеток. Некоторая доля клеток избегает кризиса благодаря восстановлению защиты хромосомных концов. Часто в этих клетках активируется теломераза, которая способствует поддержанию необходимой длины теломер [1997, J.W. Shay, S. Bacchetti, Eur. J. Cancer, A survey of telomerase activity in
human cancer]. Однако некоторые клетки избегают кризиса и в отсутствии теломеразы благодаря мало изученному механизму – «альтернативному способу удлинения теломер» (“alternative lengthening of telomeres” (ALT))  [1997, T.M. Bryan et al., Nat. Med., Evidence for an alternative mechanism for maintaining telomere length in human tumors and tumor-derived cell lines].  

Результаты исследования: Данное явление чаще встречается в саркомах. В некоторых опухолях выявляются оба механизма поддержания длины теломер [1997, T.M. Bryan, Eur. J. Cancer, Telomere dynamics and telomerase activity in in vitro immortalised human cells], в других – ни одного [2003, G.A. Ulaner et al., Cancer Res., Absence of a telomere maintenance mechanism as a favorable prognostic factor in patients with osteosarcoma]. ALT-клетки характеризуются отсутствием теломеразной активности, а также гетерогенностью длины теломер [1995, T.M. Bryan, EMBO J., Telomere elongation in immortal human cells without detectable telomerase activity]. Накоплено значительное количество данных в пользу предположения о том, что альтернативный способ удлинения теломер основан на рекомбинации. Например, в ALT-клетках выявлены PML- тельца, содержащие белки промиелоцитарного лейкоза и теломерную ДНК, а также белки, связанные с теломерами (например, TRF1 и TRF2) и белки, участвующие в рекомбинации (такие как RAD50, RAD51, RAD52, MRE11, NBS1, BLM и WRN) [2002, J.D. Henson, Oncogene, Alternative lengthening of telomeres in mammalian cells].  Было предположено, что одна теломера использует ДНК другой в качестве матрицы (15–18). 

Возможно, альтернативный способ удлинения теломер обусловлен сестринскими хроматидными обменами (СХО) в теломерах [2002, J.D. Henson, Oncogene, Alternative lengthening of telomeres in mammalian cells]. СХО – это часто встречающаяся и легко выявляемая форма рекомбинации в клетках млекопитающих. Частота СХО обычно выше в субтеломерных областях хромосом по сравнению с другими последовательностями ДНК [2001, Cornforth M.N. and Eberle R.L., Mutagenesis, Termini of human chromosomes display elevated rates of mitotic recombination]. Установлено, что скорости СХО в теломерах (Т-СХО) выше в ALT-клетках по сравнению с нормальными [2002, J.D. Henson, Oncogene, Alternative lengthening of telomeres in mammalian cells]. Частоты Т-СХО могут различаться в зависимости от генетического окружения. По данным авторов как минимум в 6 раз. Возможно, для этого необходимы мутации каких-то неизвестных генов [2004, S.M. Bailey et al., Nucleic Acids Research, Frequent recombination in telomeric DNA may extend the proliferative life of telomerase-negative cells].  


В экспериментах использовались культуры спонтанно трансформировавшихся фибробластов легкого мышей нескольких линий (с высоким уровнем репарации, с нокаутом по гену p53, с серьезным иммунодефицитом и др.). Показано, что геномные СХО происходят спонтанно во всех проанализированных типах клеток. Известно, что несколько мутаций влияют на их частоту, но не известно ни одной витальной мутации, отменяющей их.  

Можно предположить, что при СХО в уникальной последовательности происходит обмен идентичными количествами ДНК. В случае СХО внутри ДНК-повторов внедряющаяся цепь может найти гомологичную последовательность во многих сайтах. Это приводит к обмену неравными количествами ДНК.  Несмотря на то, что в целом, при этом нет прибавления или утраты теломерной ДНК, неравный Т-СХО может оказывать противоположное действие на пролиферацию клеток без теломеразы. Одна из сестринских хроматид может получить почти всю теломерную ДНК другой. Во время митоза хроматиды сегрегируют в разные клетки. Вследствие этого одна из дочерних клеток из-за утраты теломерной ДНК немедленно стареет, у другой наоборот повышается пролиферативный потенциал, и она  может основать колонию, которая произведет больше клеток до наступления её старения [2004, S.M. Bailey et al., Nucleic Acids Research, Frequent recombination in telomeric DNA may extend the proliferative life of telomerase-negative cells].  

Поскольку укорочение происходит примерно на 100 п.н. при каждом делении, прибавление 100 п.н. теломерной ДНК увеличивает число делений на одно. Например, приобретение 2 кб теломерной ДНК потенциально увеличивает пролиферативный потенциал на 20 делений. При этом клеточная колония вырастает более чем в 500 раз по сравнению с клоном, в котором не произошло Т-СХО. Этот пример иллюстрирует значительное влияние одиночного Т-СХО в клетке-предшественнике колонии. Поскольку теломерный обмен – естественный процесс, в реальной колонии он происходит постоянно (неоднократно). Дополнительные неравные Т-СХО в более поздних клеточных делениях могут еще отодвинуть старение клеток (или кризис). Если они повторяются достаточно часто, клон может постоянно избегать достижения границ своего ростового потенциала. В отличие от бессмертных клеток с теломеразой, эти клетки остаются смертными, т.е. отдельные клетки стареют.  Клетки с более длинными теломерами начинают быстрее делиться. Это объясняет нахождение в ALT-культурах как стареющих клеток, так и растущих [1995, Rogan E.M., Mol. Cell Biol., Alterations in p53 and p16INK4 expression and telomere length during spontaneous immortalization of Li-Fraumeni syndrome fibroblasts], а также увеличение средней длины теломер в ALT-культурах по сравнению с исходными культурами. Нарушения процесса обмена приводят к появлению в культурах фрагментов экстра-хромосомной теломерной ДНК [2002, J.D. Henson, Oncogene, Alternative lengthening of telomeres in mammalian cells]. Повышение Т-СХО  может служить маркером альтернативного способа удлинения теломер.  



Помимо СХО могут происходить и межхромосомные обмены (МХО), в т.ч. и в теломерных областях. Это обусловлено тенденцией к  кластеризации теломер в интерфазном ядре. Т-МХО могут давать подобный эффект, как и Т-СХО, – увеличивать продолжительность времени роста клона. В настоящее время известно, что альтернативный способ удлинения теломер в раковых клетках осуществляется благодаря одному из этих механизмов или их комбинации. 

Исследование альтернативного способа удлинения теломер важно как для понимания природы рака, так и для разработки новых методов его терапии. Скорее всего, альтернативный способ удлинения теломер контролируется не одним геном,  как в случае обусловленного теломеразой бессмертия клеток. Если в его реализации участвует множество генов, то разработка лекарственного препарата для терапии подобного рода опухолей будет непростой, в отличие от поиска ингибитора теломеразы. С другой стороны, ALT-клетки содержат несколько очень коротких теломер, и, таким образом, препараты против альтернативного способа удлинения теломер могут применяться не очень продолжительно, т.к. короткие теломеры быстро станут нефункциональными и опухоль начнет погибать [2004, S.M. Bailey et al., Nucleic Acids Research, Frequent recombination in telomeric DNA may extend the proliferative life of telomerase-negative cells].


Публикации по теме:

Теломерные обмены и асимметричная сегрегация хромосом могут объяснить неограниченные пролиферативные возможности популяций ALT-клеток.
Telomere exchange and asymmetric segregation of chromosomes can account for the unlimited proliferative potential of ALT cell populations.
Blagoev KB, Goodwin EH.
DNA Repair (Amst). 2008 Feb 1;7(2):199-204.

Часто происходящая рекомбинация в теломерной ДНК может продлевать пролиферацию клеток без теломеразы.
Frequent recombination in telomeric DNA may extend the proliferative life of telomerase-negative cells.
Bailey SM, Brenneman MA, Goodwin EH.
Nucleic Acids Res. 2004 Jul 16;32(12):3743-51. Print 2004.

ДНК и теломеры: начало и конец.
DNA and telomeres: beginnings and endings.
Bailey SM, Goodwin EH.
Cytogenet Genome Res. 2004;104(1-4):109-15.


Контактная информация:

Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM 87544, USA.
Web-site: http://www.lanl.gov/